近年来，mRNA技术作为一种新兴的生物技术，展现出了巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这一技术为疾病的预防和治疗开辟了全新的视角。然而，mRNA技术的发展道路并非一帆风顺，其中最大的挑战之一即是副产物双链RNA（dsRNA）的形成。dsRNA作为一种免疫刺激分子，容易引发机体免疫反应，从而对mRNA的安全性和有效性造成影响。因此，如何减少dsRNA的形成，成为mRNA技术领域亟待解决的关键问题。

传统的解决方案依赖复杂的纯化工艺，成本高、效率低，并且难以完全清除微量dsRNA。T7RNA聚合酶（T7RNAP）作为mRNA体外转录的核心工具，其天然活性（如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性）被认为是dsRNA形成的重要因素。因此，通过定向进化或理性设计改造T7RNAP，成为全球科研团队争相探索的方向。

在这一背景下，我们的团队于2024年3月3日在FEBS Journal上发表了题为《工程化T7RNA聚合酶通过降低末端转移酶和RNA依赖RNA聚合酶活性减少dsRNA形成》的研究论文。我们的研究成功通过工程化改造T7RNAP，将体外转录过程中dsRNA的生成显著降低至野生型的仅18%，同时显著提升了mRNA的整体效率与质量，推动了基因治疗和疫苗开发的快速进展。

在研究中，我们结合了定向进化与半理性设计的方法，成功筛选出多种高效且低毒的T7RNAP突变体，它们在减少dsRNA形成方面展现出色。我们构建了随机突变库，并设计了一种实时监测液滴内RNA产物完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，借助荧光激活液滴分选（FADS）技术进行高通量筛选，最终筛选出候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T），其dsRNA含量显著低于野生型。

通过半理性设计方法，我们构建了十个单点饱和突变库，利用微孔板筛选技术识别有益突变体。在筛选超过1000个突变体后，发现关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）产生的dsRNA含量远低于野生型，且未影响转录效率。

为了进一步优化突变体，我们针对上述突变位点构建了DNA重组文库，并通过微孔板筛选获得了组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验结果显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中可达到仅0.007 ng/μg。这一结果不仅在体外实验中得到验证，在细胞实验中同样表现出显著的免疫原性降低及蛋白翻译效率提升。

在RAW264.7细胞中，最优突变体M11产物引发的干扰素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表达量仅为野生型的97%和1293 pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA的形成能够有效解除PKR介导的翻译抑制，从而释放mRNA治疗潜力。

为深入了解突变体降低dsRNA的机制，我们运用计算机模拟与功能实验，揭示突变体的dsRNA降低主要归因于RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）及末端转移酶活性的减少。这一发现为未来进一步优化T7RNAP提供了重要的理论基础。

本研究为T7RNAP的改造提供了新的方法与思路，为mRNA技术的发展注入了新活力。通过减少dsRNA的形成，我们有效提升了mRNA的质量与安全性。凭借此研究成果，我们推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNA聚合酶GMP级（低dsRNA，250U/μL））。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的蓬勃发展，并为生物医学领域带来更多的可能性。

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